氧载体强化传氧促进分枝杆菌AD的生物合成

作者:6up  来源:6up扑克  时间:2020-04-22 16:04  点击:

  内容提示:天 津 科技 大 学 研 宄 生 学 位 论 文  ( 申 请 工 程硕 士 学 位 ) 氧 载 体 强 化传氧促 进 分 枝 杆 菌 A D 的 生 物 合 成  O X Y G E N  V E C T O R  E N H A N C E D  O X Y G E N  T R A N S F E R  T O  P R O M O T E  T H E  S Y N T H E S I S  O F  A D  M Y C O B A C T E R I U M  工 程 领 域 : 轻 工 技 术 与 工 程 ( 发 酵 ) 指 导 老 师: 王 敏 教授  研 究 生 姓 名: 张 文 凯  申 请学 位 级 别: 工 程 硕 士 ( 全 日 制 )  论 文 提 交 时 间: 2 0 1 6 年 3 月  分 类 号:Q 93 6  学校代 码: 1 0 0 5 7  密 级:  研 宄 生 学 号:1 3 8 0 9 9 3 6 氧 载 体 强 化 传...

  天 津 科技 大 学 研 宄 生 学 位 论 文  ( 申 请 工 程硕 士 学 位 ) 氧 载 体 强 化传氧促 进 分 枝 杆 菌 A D 的 生 物 合 成  O X Y G E N  V E C T O R  E N H A N C E D  O X Y G E N  T R A N S F E R  T O  P R O M O T E  T H E  S Y N T H E S I S  O F  A D  M Y C O B A C T E R I U M  工 程 领 域 : 轻 工 技 术 与 工 程 ( 发 酵 ) 指 导 老 师: 王 敏 教授  研 究 生 姓 名: 张 文 凯  申 请学 位 级 别: 工 程 硕 士 ( 全 日 制 )  论 文 提 交 时 间: 2 0 1 6 年 3 月  分 类 号:Q 93 6  学校代 码: 1 0 0 5 7  密 级:  研 宄 生 学 号:1 3 8 0 9 9 3 6 氧 载 体 强 化 传 氧 促 进 分 枝 杆 菌 A D 的 生 物 合成  O x y g e n  V e c t o r  E n h a n c e d  O x y g e n  T ra n s f e r  t o  P r o m o t e  t h e  S y n t h e s i s o f  A D  b y M y c o b a c t e r i u m 工 程 领域: 轻 工 技 术 与 工 程( 发 酵 ) 指 导 教 师: 王 敏 教授 研 宄 生 姓 名: 张 文 凯  申 请 学 位 级 别:工 程 硕 士( 全 日 制 )  论 文提 交 日 期: 2 0 1 6 年 3 月 课 题 来 源 : 国 家 自 然 科 学 基金  学 位 授 予 单 位: 天 津 科 技 大 学  天 津 科 技 大 学  学 位 论 文 原 创 性 声 明  本 人 郑 重 声 明: 所 呈 交 的 论 文 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下 独 立 进 行 研 究 工 作 所 取 得 的  成 果 。 除 文 中 特 别 加 以 标 注 引 用 的 内 容 外, 本 论 文 不 包 括 任 何 其 他 个 人 或 集 体 已 经 发  表 或 撰 写 的 成 果 内 容, 也 不 包 括 为 获得 天 津 科 技 大 学 或 其 它 教 育 机 构 的 学 位 或 证 书 而  使用过 的 材 料 。 对 本 文 研 究 做 出 重 要 贡 献 的 个 人 和 集 体 , 均 己 在文 中 以 明 确 方 式 标 明。  本 人 完 全 意 识 到 本 声 明 的 法 律 后 果 由 本 人 承 担。  作 者 签 名 :黍 妙 V 曰 期:n / 4 年  > 月曰  知 识 产 权 和 专 利 权 保 护 声 明  本 人 郑 重 声 明 : 所 呈 交 的 论 文 是 本 人 在 导 师 具 体 指 导 下 并 得 到 相关 研 宄 经 费 支 持  下 完 成 的 , 其 数 据 和 研 宄 成 果 归 属 于 导 师 和 作 者 本 人, 知识 产 权 单位属 天 津 科 技 大 学 ;  所 涉 及 的 创 造 性 发 明 的 专 利 权 及 使 用 权 完 全 归 天 津 科 技 大学 所 有。 本 人 保 证 毕 业 后,  以 本 论文数据 和 资 料 发 表 论文 或 使 用 论 文 工 作 成 果 时 署 名 第一 单位仍 然为 天 津 科 技  大 学。本 人 完 全 意 识 到 本 声 明 的 法 律 后 果 由 本 人 承 担。  作 者 签 名 1 / 曰 期 年士月{曰  学位 论 文 版 权 使 用 授 权 书  本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解学校有关 保 留、使 用 学 位 论 文 的 规 定, 同 意学校保 留 并  向 国 家有 关 部 门 或 机 构 送 交 论文 的 复 印件和电 子 版 , 同 意公布论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 , 允 许 论 文 被 查 阅 和 借 阅。 本 人 授 权 天津科技 大 学 可 以 将本学位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容  编 入 有关 数 据 库 进 行 检 索 , 可 以 采 用 影 印、 缩 印 或 扫 描等复制 手 段 保 存 和 汇 编 本 学 位  论 文 。 保 密 □(请在方 框 内 打“V”) , 在  年 解 密 后 适 用 本 授 权 书 。 本 学位 论 文 属 于 不 保 密P ( 请在 方 框 内 打“V”) 。  作 者签 名:曰 期: 年¥ 月曰  导 师 签 名:曰 期: 年 '月^曰   摘 要  雄 稀 二 酮 ( A n d r o s t- 4 - e n e - 3,1 7- di o n e, AD ) 是 制 备 甾 体 激 素 类 药物 的 重 要 中 间 体, 可  通 过 分 枝 杆 菌 选 择 性 切 除 植 物 甾 醇(p h y to s t e r o l , P S ) 侧 链 获 得,分枝杆 菌 转 化 P S 是  强 好 氧 发酵过 程 , 溶 氧 对 A D 的 积 累 有 重要 影 响 。 氧 载 体 强化传 氧 是 改善溶氧 水 平 的  一 条 新 途 径。 本 课 题 以 分 枝 杆 菌TC C C  1 1 02 8  M 3 A A ^ D ) 降 解 P S 生 成 A D 为 研 宄 对 象 , 研 究 了 不 同 氧载 体 对 降 解  P S 生 成 A D 产 率 的 影 响,并 对 氧 载 体 提 高 P S 侧 链 降 解 反 应 的 机 制 进 行 了 初 步 分析。  首 先 建 立 了 含 油 转 化 体 系 中 取 样 的方法, 其 次 考 察 了 常 见 的 五 种 氧 载 体 ( 全 氟 己  烷 、正 十 六 烷 、 豆 油 、 聚 二 甲 基 硅 油 、 聚 甲 基 苯基 硅 氧 烷 ) 对 P S 的 转 化 能 力 , 结 果  表 明1 6 %  ( v / v ) 豆 油 为 最 优 氧载 体, 第 5 d 时 A D 摩 尔 生 成 率 达 5 2 . 6 8 % 。 对 以 豆 油 为 氧 载 体 的 转 化 体 系 优 化 结 果 表 明, 豆 油 的 最 优 添 加 时 间 为 发 酵 初 始 时, 最 优 装 液 量  为1 0 0  m L, 反 应3 d 时 A D 产 率最 高 , 达 5 7 . 5 0 % , 较 对 照 组 提 高 了  6 倍 。  考 察 了 豆 油 添加 对 发 酵液 溶氧 的 影 响, 结 果 表 明, 豆 油 的 添 加 可 以 改 善 发 酵 液 体  积 溶 氧 传 质 系 数 ( k L a ) , 当 豆 油 浓 度 > 2. 5 %,k L a 值随着 油 相 体 积 分 数 的 增加 而 增 大 。  分 析 豆 油 添 加 对 分枝 杆 菌细 胞 内 辅 因 子 含量 及T C A 循 环 中 关 键 酶 酶 活 的 影 响 ,  发 现 菌 体 胞 内 A T P 和 N AD+ 含 量 增加 , NA D _ A D+ 比 率下 降 ,同 时 伴 随着 异 柠 檬 酸  脱 氢 酶 ( I C DH c ) 和 a- 酮 戊 二 酸 脱 氢 酶( a- KG D H) 酶 活 的 提 高。甾 醇 代 谢 途 径 分 析  表 明, 豆 油 作为 氧 载 体 通 过 提 高 发 酵 液 中 氧 传 递 , 加速 了 菌 体 内 电 子 呼 吸 链 ( E T C )、  氧化 磷 酸 化 和 三 羧 酸 ( T C A ) 循 环 , 促 进 了  P S 侧 链 降 解 途 径 , 从 而 有利 于 A D 的 生  物 合 成, 据 此 推 测 出 分 枝 杆 菌 P S 侧 链 降 解 过 程 中 主 要辅 因 子 的 代谢路 径 。 考 察 了 豆 油 对 分 枝 杆菌细胞 脱 氢 酶 酶活及通透性的 影 响, 当 豆 油浓度为1 6 % 时,  菌体 脱 氢 酶 酶 活 仍 能 保 持 在 8 5 % 以 上 , 细 胞 的 通 透 性 增 大 但 并未失去 催 化 活 性 和 完 整  性, 通 透 性 的 适 当 改 变 在一 定 程 度 上 有利于底 物 的 摄 取, 这 可 能是 除 增 溶 与 富氧作用  -夕 卜, 豆 油 提 高 底 物 转 化 率 的 另一 个 重 要因 素。  考 察 了 氧载体与 不 同 乳 化剂联合 使 用 对 AD 生 物 合 成 的 影 响 , 结 果 表 明 卵 磷 脂 和  T w e e n  8 0 / S p a n  8 0 对 A D 的 合 成具 有 促 进 效果 , 其 中 卵 磷 脂 的 效 果 最 佳 , 加 入 豆 油 的  间时 添 加 0 . 6 % 的 卵 磷 脂, A D 产 率 达 6 8 . 0 9 % 。 关 键 词: 分枝杆 菌; 氧 载 体 ; 豆 油 ; 植 物 甾 醇 ;NAD H / N A D+;  A T P  A B S T RACT  A n d r o s t - 4 _ e n e, 3,1 7- d i on e ( A D )  is  a n  i m p o r t a n t i n t e r m e d i u m  o f  s t e r o l  h o r m o n e s,  w h i c h  c a n  b e  o b t a i n e d  v i a  t h e  s i d e  c h a i n  c l e av a g e  o f p h yt o s t e r o l  ( P S )  b y  M y cob a c t e r i u m .  P S  t r a n s f o r m a t i on  b y  M y c oba c t e r i u m  i s  s t r on g l y  d e p e n d e n t  o n  d i s s o l v e d  o x y g e n  c o n c e n t r a t i o n .  T h e  d i s s o l v e d  o x yg e n  h a s  i m p o r t a n t  i n f l u e n c e  o n  t h e  A D  a c c u m u l a t i o n . T w o- p h a s e f e r m e n t a t i o n  s y s t e m  w i t h  t h e  a dd i t i o n  o f  ox y g e n  v e c t o rs  b e c o m e  a p o s i t i v e t r e n d  i n  t h i s  fi e l d .  I n  t h i s p a p e r , t h e  b i o t r a n s fo r m a t i o n  o f  P S  t o  A D  b y M y c o ba ct e r i u m n e o a u r u m  T CC C  1 1 0 2 8  M 3  A k s d D  ( M N R  M 3 A k s d D )  w a s  s e l ec t e d  a s  a  m o d e l  s y st e m  f o r  e v a l u a t i n g  d i f fe r e n t  o x yg e n  v e c t o r s  o n  A D  y i e l d .  T h e  m e c h a n i s m  und e r l y i n g  t h e  e f f e c t s  o f  ox y g e n  v e c t o r  o n  t h e  s i d ec h a i n  d e g r a d a t i o n  o f  P S  w e r e  a l s o  a n a l y z e d .  F i r s t l y ,  a  r e l i a b l e  s a m p l i n g  m e t h o d  w a s  e s t a b l i s h e d ,  s e c o n d l y,  s e v e r a l  ox y g e n  v e c t o r s ( n- h e x a d ec a n e,  p e r f l uo r o h e x a n e ,  s o y b e a n o i l,  p o l y d i m e t h yl  s i l ox a n e,  p ol y m e t h y l p h e n y l s i l o x a n e )  w e r e  s e l e c t e d  t o  i n v e s t i g a t e  t h e i r  t r a n s f o r m a b i l i t y f o r P S .  T h e r u s u l t s  s ho w e d  t h a t  1 6 %( v / v )  s o y b e a n  o i l  w a s  p r o v e d t o  b e  t h e  m o s t  s u i t a b l e  f o r  A D p r o d u ct i o n,  t h e  l a r g e s t  m o l a r  y i el d  o f  A D  w a s  5 2 . 6 8 %  a t  t h e  f i f t h  d a y .  O p t i m i z a t i o n  r e s u l t s  o f  s o y b e a n  o i l  i n d i c a t e d  t h a t  t h e  a dd i t i o n  o f  1 6 %  ( v / v )  s o y b e a n  o i l  t o  t h e  l i q u i d  m e d i u m  a t  t h e  t i m e  o f  i n oc u l a t i o n  w a s  fo u n d  t o  b e  o p t i m a l,  t h e  p e a k  m o l a r  y i e l d  o f A D  ( 5 7 . 5 0 % )  w a s a c h i e v e d  a t  t h e  t h i r d  d a y,  i n c r ea s e d  b y  6- f o l d  h i g h e r  t h a n  t h e c o n t r o l  g r o u p . T h e  e f f e c t s  o f  s o y b e a n  o i l  o n  d i s s o l ve d  o x yg e n  w e r e  i n v e s t ig at e d .  T h e  r e s u l t s  s h o w e d  t h a t  s o y b e a n  o i l  c o u l d  i m p r o v e d t h e  o x yg e n  v o l u m e t r i c  m a s s  t r a n s f e r  r a t e  ( k L a ),  w h e n  t h e c o n ce n t r a t i o no f  s o y b e a n o i l > 2 . 5 %,  k L a  i n c r e a s e d  a l m o s t  l i n e a r l y  w i t h  t h e  i n c r e a s e  o f s o y b e a n  o i l .  T h e  i n t r a c e l l u l a r  nu c l e o t i d e  l e v e l s  a n d  t h e e nz y m e  a c t i v i t i e s  i n v o l v e d  i n  T C A  c y c l e  w e r e  m o n i t o r e d .  H i g h e r  A T P  l e v e l  a n d  a  l o w e r  N AD H / N A D+ r a t i o  w e r e  o b t a i n e d  w i t h  1 6 % s o y b ea n  o i l  i n  b r o t h ,  b o t h  o f  t h e  a c t i v i t i e s o f  i s o c i t r a t e  d e h y d r o g e n a s e  ( I C D H c )  a n d a- k et o g l u t a r a t e  d e h y d r o g e n a s e  ( a- K G D H)  w e r e  ob v i o u s l y  u p- r eg ul a t e d .  A n a l y s i s  of  m e t a b o l i c  p a t h w a y s  s h o w e d  t h a t  t h e  e l e c t r o n  t r a n s f e r  c h a i n ( ET C ) ,  o xi da t i v e p h o s p h o r yl a t i o n  a n d  t r i c a r b o x y l i c  a c i d  ( T C A ) c y c l e  o f  M N R  w e r e  s t i m u l a t e d  w i t h  s o y b e a n  o il,  w h i c h  r e s u l t e d  i n  e n h a n ce d  A D  y i e l d.  B a s e d  o n  t h i s,  w e  d e du ce d  t h a t  t h e  m a i n  c o f a c t o r m e t a b o l i s m  o f  P S  s i d e  c h a i n  c l e a v a g e i n  M N R . T h e  e f f e c t s  o f  s o y b e a n  o i l  o n  t h e  c e l l  d e h y d r o g e n a s e  a c t i v i t y  a n d  p e r m e a b i l i t y  w e r e s t ud i e d .  A f t e r p r et r e a t m e n t  b y  1 6 %  s o y b e a n  o i l,  t h e  d e h y d r o g e n a s e  a c t i v i t y  r e m a i n e d  a t  8 5 % a b o v e ,  t h e  a l t e r a t i o n  o f  c e l l  p e r m e a b i l i t y  w a s ob s e r v e d  b u t  ce l l s d i d  l o s e  n e i t h e r  c a t a l y t i c  a c t i v i t y n o r c e l l  i n t e g r i t y,  w h i c h  a l s o  p o s s i b l y  favo r a b l e  i n f l u e n ce d  s t e r o l  u p t a k e .  T h i s  m a y b e  a n o t h e r  r e a s o n  t h a t  s o y b e a n  o i l  r a i s e d  t h e  P S  c o nv e r s i o n .   T h e  s y n e r g i s t i c  e ff e c t s  o f  o x y g e n  v e c t o r  a n d  d i f e r e n t s u r fa c t a n t s  fo r  AD  b i o s y n t h e s i s  w e r e  s t u d i e d .  R e s u l t s  s h o w e d  bo t h  o f  l ec i t h i n  a nd  T w ee n  8 0 / S p a n  8 0  e x h i b i t e d p r o m o ti n g e f f e c t  o n  A D  b i o s y n t h e s i s .  T h e  b e s t  e f f e c t i o n  i s  l e c i t h i n ,  t h e p e r ce n t a g e  yi e l d  o f  A D  r e ac h 68 . 0 9 %  w i t h  0 . 6 %  l ec i t h i n  i n  s o y b e a n  o i l .  K e y w o rd s :  M y c o b a c t er i u m  n e o a u r u m,  o x y g e n v e c t o r,  p h y t o st e r o l,  N A DH  / NAD+9  A T P  英 文 缩 略 表  英文 缩 写  英 文全 称  中 文 名 称  M N R  M 3 A k s d D  My c o b a c t e r i u m  n e o a u r u m  T C C C  11 0 2 8  新 金 分 枝 杆 菌 M 3 A f e / D  M 3 A k s d D AD  A n d r o s t- 4 - e n e - 3,1 7- di o n e  雄 留- 4 - 烯 - 3,1 7- 二酉 同  A D D  A n d r o s t-1, 4- di e n e- 3,1 7 - d i o n e  雄 甾-1, 4- 二 烯 - 3, 1 7- 二 酮 P S  P h y t o s t e r o l  植 物 甾 醇  DO  D i s s o l v e d  o x y g e n  溶 解 氧  k L a  V o l u m e t r i c  ox y g e n  t r a n s f e r  c o e f f i c i e n t  体 积 溶 氧 传 递 系 数 N A D H  R e d u c e d  c o e n z y m e  I  还 原态 辅 酶 I  N A D+  Ox i d i ze d  c o e n z y m e I  氧 化 态 辅 酶 I T C A  T r i c a r b ox y l i c  a c i d  c y c l e  三 竣 酸 循 环 E T C  E l e c t r o n  t r an s f e r  c h a i n  电 子 呼 吸 链 I C D H c  I s o c i t r a t e  d e h y d r o g e n a s e  异 杆 檬 酸 脱 S L 酶  a- K G D H  a - k e t o g l u t a r a t e  d e h y d r o g e n a se  a - 酮 戊 二 酸 脱 氛 酶 O D  O p t i c a l  d e n s i t y  O D 值   目 录  1  I ff 言 1  1 . 1 .  A D 的结 构 、 理 化 性 质 及 功能 1  1 . 2  A D 的 生 产 方 法  1  1. 2 . 1 化 学 半 合 成 法 1  1 . 2. 2微 生 物 合 成 法 2  1 . 3 氧 载 体 概 述  6 1 . 3 . 1氧载体 6  1 . 3 . 2 氧载 体 的 分 类  7 1 . 3 . 3 氧 载 体 强 化 传 氧 的 机 理 模 型  7 1 . 3 . 4 氧 载体 的 优 点 及 应 用  8 1 . 3 . 5氧载体 对 菌 体 内 辅 因 子 含 量 及 T C A 循 环 中 相 关酶 活 的 影 响9  1 . 4本 论 文 的 研 宄 意 义 和 研 宄 内 容1 0  1 . 4 . 1 研 究 意 义  1 0  1 . 4 . 2 研 宄 内 容  1 0  2材 料 与 方 法 1 2  2 . 1 实 验 材 料 1 2  2 丄 1 实 验 菌 株 1 2  2 丄 2 培 养 基 1 2  2 . 1 . 3实 验 试 剂1 2  2 . 1 . 4实 验 仪 器 1 3  2 . 2实 验 方 法 1 4  2 . 2 . 1 菌 体 活 化  1 4 2 . 2 . 2 菌体 的 培 养  1 4 2'. 2 . 3 含有 氧 载 体 体 系 的 植 物 甾 醇 生 物 转化反应1 4  2 . 2 . 4 静 息细 胞 制 备 1 4  2 . 2 . 5 植 物 甾 醇 溶 解度 的 测 定  1 5 2 . 2 . 6 转 化 产 物 的 鉴 定  1 5 2 . 3 分 析 方 法  1 5  2 . 3 . 1 两 相体系中 菌 体 生 物 量 的 测 定 1 5  2 . 3. 2 体 积 溶 氧 传质系 数 测 定 1 5  2 . 3 . 3 分 枝杆菌内 N A D H 、N A D + 的 测 定  1 6  2 . 3 . 4分枝杆 菌 内 A T P 的测定1 7 2 . 3 . 5 分枝杆菌 T C A 循 环 中 关 键 酶 酶 活 的 测 定1 8 2 . 3 . 6 分枝杆菌 细 胞 蛋 白 含 量 的 分 析 1 8  I   2 . 3 . 7 分 枝 杆 菌细 胞 通 透 性 的 测 定  1 9  2 . 3 . 8 分 枝 杆 菌 细 胞 脱 氢 酶 酶 活 的 测 定  1 9  2 . 3 . 9甾 体 化 合 物 的 检 测 1 9  3 關 与 讨 论  2 3  3 . 1 氧 载 体 的 选择与优 化  2 3  3 . 1 . 1油 相 体 系 中 取 样方法的 建 立 2 3  3 . 1 . 2 氧 载体 的 选 择  2 4  3 . 1 . 3氧 载体 的 优 化 2 9  3 . 2 豆 油 对植物甾 醇 侧 链 降 解 反 应 的 影 响3 0  3 . 2 . 1 转 化 产 物 的 结 构 鉴 定  3 0  3 . 2 . 2 豆 油 对 植 物 甾 醇 转 化 反 应 的 影 响  3 1  3 . 3 豆 油 提 高分枝 杆 菌 A D 生 物 合 成 的 机 理 分 析  3 2  3 . 3 . 1 豆 油 对 发 酵 液 中 溶 氧 的 影 响  3 2  3 . 3 . 2 豆 油 对分 枝 杆 菌 细 胞 脱 氢 酶 酶 活的 影 响  3 7  3 . 3 . 3 豆 油 对分枝杆 菌 细 胞 通 透 性的影响  3 8  3 . 4 豆 油 和 乳化 剂 联 合 使 用 对 分 枝 杆 菌 A D 生 物 合 成 的 影 响  4 0  4结 论 4 3 5 展 望  4 4  6 参 考 文 献  4 5  7 攻 读 硕 士 学位 期 间 发 表 论 文 情 况  5 3  8 致 谢  5 4  I I    天 津 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文   1 前 言  1 . 1 .  A D 的 结 构、 理 化 性 质 及 功 能  A D, 化学 名 称 : 雄 甾-4- 稀 -3 , 1 7- 二 酮( a n d r o s t- 4 - e n e - 3, 1 7- di o n e ) , 分 子 式 :  C1 9 H 2 6 〇 2, 其 相 对 分 子 质 量 : 2 8 6 . 4 1 , 熔 点( M e lt i n g  p o i n t ) :  1 6 8?1 7 3C,比 旋 度  ( s p e c i fi c  r o t a t i o n ) :  + 1 9 3? 20 2, 外 观 呈 准 白 色 晶 体 粉 末, 无 异 味 , 无 毒 性,  溶 于 乙 醇 、 醋 酸 、乙 醚 等, 微 溶 于 水 , 结 构 式 见 图1-1 。  〇 h 3/?  图1-1  A D 的 结 构 式 F i g .  1- 1  S t r u c t u r e o f A D  A D 是 在 结构和药 理 上 与 睾 丸 素 极 其 相 似 的一 种化 合 物 , 拥 有 很 多 雄 性 激 素  的 基 本 性 质 , 例 如 键 合 到 雄 性 激 素 受 体 的 配 基键合 区 域 , 诱 导其核的 移 位 和 促 进  成 肌 细 胞 的 分 化 等 ; 它 的 促 蛋 白合 成活性 大 概 有 睾 丸 素 的 五 分 之一, 所 以 被 认 为  是一种 促 蛋 白 合 成 留 类[1]。AD 是 留 体 激 素类 药物 不 可 替 代 的 中 间 体 , 对 机 体 起  着 非 常 重 要 的 调 节作 用 , 可 以 说 几 乎 所有 留 体激 素 药 物 都 是 以 A D 作 为 起 始 原 料  进 行 生 产 的。 A D 不 仅 用 于 生 产 雄 性 激 素 类 和 促 蛋 白 合 成 类 药 物, 又 可 用 于 合 成  氢 化 可 的 松、 氢 化 泼 尼 松 、 黄 体 酮 、 雌烯 醇 、 孕 激 素 、 地 塞 米 松 等1 0 0 余种 药 物 ,  近 年 来 更 是 大 量 用 于 生 产 利 尿 药 物 螺 内 酯 及 计 划 生 育 药 物 苯 丙 酸 诺 龙 、 米 非 司 酮  等 重 要 激 素药 物。 如 今 A D 仍 不 断 被 用 于 开 发 和 生 产 新 的 医 药 品 种, 研 宄 A D 的 制 备 技 术 应 用 前景 广阔 。  1 . 2  A D 的 生 产 方 法  1 . 2 . 1 化 学 半 合 成 法  早 期 的 甾 体 药 物 生 产 主 要 集 中 在 化 学 半 合 成 法, 即 从 天 然 产 物 中 取 得 含 有 甾 体 基 本 骨 架 的 化合 物 为 原 料 , 再 进 行 化学 结 构 改 造 而 成。 较 典 型 的 途 径 是 薯 蓣 皂  素 元 法, 该 方 法 是 从 野 生 中 药 材“穿 地 龙”等植 物 中 提 取 薯 蓣 皂 素 , 再 进 行 化 学  结 构 改 造 而 成。随 着 甾 体 药 物 工 业 对薯 芋皂 素 的 需 求 日 增 , 薯 芋 资 源 日 渐 枯 竭 ,  加 之 人们 无秩 序、 不 科 学 采 挖, 严 重 破 坏 了 地 表 植 被 和 生 态 环 境; 另 外 通 过 化 学  1   1 前 言  半 合 成 法 合 成 AD , 需 要 经 过 复 杂 的 反 应 过 程,副 产物 多 , 产率 偏 低, 给 后 续 的  提 取 工 艺 增 加 了 难 度 , 并 且 甾 体 化 合 物 结 构 十 分 复 杂 , 含有 几 个 不 对 称 中 心 , 尤  其 是 它 的 活 性 高 低 多 取 决 于 特定 位点 的 取 代 基 , 这就给化 学 合 成 法 带 来 了 极 大 的  困 难。  1 . 2 _ 2 微 生 物 合 成 法  微 生 物 合 成 法 即 以 自 然 界 丰 富 存 在 的 动 植 物 甾 醇 为 原 料 , 通 过 微生 物 转 化 技  术 将 甾 醇 侧 链 选 择 性 切 除 得 到 产 物。 留 体 化 合 物 微 生 物 转 化 与一般 的 氨 基 酸 和 抗  菌 素 发 酵 不 同 , 转 化 产 物 不 是 微 生 物的代谢 产 物, 而 是 利 用 微 生 物 所 产 生 的 酶 对  底 物 的 某一部 位 进 行 特 定 的 生 物 化 学 反 应 来 获 得一 定的 产 物 , 也 就 是 留体 类一般  不 是微 生 物 代 谢 途 径 中 起 生 理 作 用 的 物 质 , 因 此,甾 体 类 物 质 像 其 它 营 养 物 质一  样 , 会 被 微 生 物最 终 分 解 为 c o 2 和 h 2 o。  微 生 物 转 化 留 体 的过程可 用 以 下 通 式 表 示 , 有 人把 这一过 程 视 为 微 生 物 对 甾  体 底 物 的 解 毒 反应[ 2 ]。 在整个过 程 中, 微 生 物 的 生 长 和 留 体 的 转 化 完 全 可 以 分 开 ,  起 转 化 作 用 的酶 为 由一定 的 底物 诱 导 而 产 生 的 诱 导 酶。  底 物?菌 体 细胞?产 物  微 生 物 转 化 技 术 可 以 充 分 利 用 酶 的 灵 敏 性 、 特异 性 , 多 样性等 , 相 对 于 传 统  的 化学 合 成 而 言 , 这 种 以 天然 甾 体 作 为 骨 架利用微 生 物 进 行 结 构 改 造 的 的 制 备 方  法 具 有 减 少 合 成步 骤, 缩 短 生 产 周 期 ,专一性 强, 副 反 应 少 , 条 件 温和 , 环 境 友  好 等 优 点。 在 许 多 留 体 药 物 或 其 中 间 体 合 成 路 径 中 , 微 生 物 转 化 技 术 己 经 成 为 不  可 或 缺 的 关 键 性 技 术[ 3 , 4 1。  1 . 2 . 2 . 1 可 代 谢 甾 类 物 质 生 成 A D 的 微 生 物  1 9 4 4 年 , T u r f i t t 等[ 5 1 第一次 报 道 了 分 枝 杆 菌 能 利 用 胆 固 醇 及 P S 作为生长 繁  殖 的 唯一碳 源 , 但 它 除 了 降 解 甾 醇 侧 链 外 , 还 进一步 降 解 甾 体 的 骨 架, 因 此 不 能  用 于 生 产 留 体 激素 的 中 间 体 如 A D 等 , 但 这 己 推 进 了 微 生 物 转 化 甾 体类 化 合 物 的  进 程。 1 9 6 0 年 S i h C J等[ 6 】 首 先发 现 有 些 微 生 物 可 以 选 择 性 切 除 甾 醇 的 饱 和 侧 链  而 得 到 A D 和 AD D , 随 后 的 时 间 里 许 多 科 研 团 队 都 相 继 报 道 了 利 用 不 同 的 微 生  物 将不 同 来 源 的 不 同 留 体化 合 物 进 行 侧 链 降 解 , 这 使得 微 生 物 转 化 的 工 业 化 生 产  成 为 可 能。 表 1-1 详 列 了 能 将 甾 醇 类 转 化 成 A D 的 微 生 物 。  2    天 津 科 技 大 学 硕士 学位论 文  表1- 1微 生 物 降 解 不 同 底物 生 产 A D T a b l e  1-1  M i c r o b i a l  d e g r ad a t i o n  o f d i f f e r e n t  s ub s t r a t e s  f o r p r o d u c ti o n  o f A D  M  微生 物  胆 固 醇  简 单 节 杆 菌d  胆 固 醇  溶 脂短 杆 菌(H  胆 固 醇  珊 湖 红 球 菌( i ? A 〇 i i oc o c c M sc o r a 〃 z > j e) [ 21]  胆 固 醇  分 枝 杆 菌( A fy c o Z^ a c Z e r / M f f i  s p . N R R L  B- 3 6 8 3  )【 8 9 】  胆 固 醇  玫 瑰 色 微 球 菌( M f cr o c o c c w s r o s e z w ) [1 ( )]  胆 固 醇  腐 皮 镰 刀 菌 ( i r w s a n'M / M  s o / a n f ) 谷 甾 醇  诺 卡 氏 菌( i V o c a r c / f a  ) [ 7 ]  谷 甾 醇  假 单胞 菌( P s e w i / o / w o / w s s p. N C I B  1 0 5 9 0 ) [ 7 ] 谷 甾 醇  分 枝 杆 菌( 从 少 £ : 〇 6 〇 < ^ 奶'1 / ? 1 )[ 1 2 ]  孕 酮  曲 霉  d s / 7 e r g " / w s fl M m > / M / g e ? s) [1 3】  孕 酮  球 形 芽 抱 杆 菌( ? S ac f / Z M Ss p / z a e W c i w)  % 孕 酮  赤 球 丛 赤 壳 菌( i V e c / W a / i a e / w a to c oc c a ) [1 5]  麦 角 固 醇  分 枝杆 菌( A fy c o 办s p . B C S  3 9 6 )[丨 6]  P- 谷甾 醇  分 枝 杆 菌( A < y c o Z ) a c 化 W w ws p . N R R L  B- 3 8 0 5, VK M  A C-1 8 1 5 D ) [1 7 1 8]  植 物 留 醇  分 枝杆 菌( A fy c o A a c r e WM ff j  s p . M B- 3 68 3 , s p- U V - 8)丨1 9 * 2 0]  在 众 多 可 降 解 留 类 的 微 生 物 菌 属 中 , 分 枝 杆 菌 属 因 其卓 越的 生 物 代 谢 能 力 受  到 最 为 广 泛 的 关 注 , 经 过 诱 变 选 育 后 可 作 为 积 累 甾 药 中 间 体A D( D ) 等 的 重要 生  物 媒介1 8 , 9 ,1 2,1 6 #]。 分 枝 杆 菌 属 微 生 物 有 诸 多 适 用 于 甾 类 生 产 的 特 性:(1 )细 胞 壁 的 组 成 中 含 有 致 密 的分 枝菌 酸 层 , 可 以 耐 受 甚 至 可 以 生 存 在 高 浓 度 有 机 环 境 中 ,  该 特 性 使 其 很 好 的 适 用 于 油 水 两 相 发 酵[ 2 2 ];  ( 2 ) 拥有 完 善 的 留 类 降 解 基 因 簇 ,  含 种 类 丰 富 的 特 异 性 加 氧 酶 , 氧 化 还 原 酶 以 及P- 氧 化酶 系, 确 保 了 微 生 物 对 底  物 的 高 速 代 谢[ 2 3 ];  (3) 分 枝杆 菌 属 多 数 表 现 为 快 速生 长 , 易? 培养 增 殖, 是 理 想  的 甾 类 反 应 生 物 媒 介。  1 . 2 . 2 . 2 微 生物 A D 合 成 的 转 化 工 艺  与 化 学 合 成 相 比 , 微 生 物 转 化 虽 然 具 有 高 选择性、 温 和 的 反 应 条件等特 性 ,  但 常 常 受 到 甾 体底 物 的 低 水 溶 性( 约 1  p m o l / L 左 右 , 此 为 制 约 留 体转化 的 主 要  因 素)[ 2 4 ]、细 胞 膜 / 细 胞 壁 的 阻 碍 作 用、 底 物产物 的 毒 害 作 用 以 及 产 物 后 期 降 解  等 问 题 的 困 扰, 对 此 , 研 宄 者 们 针 对 性 的 尝 试 了 各 种 方式 ,不 断 的 改 进 着 发 酵 工  艺 , 以 期 提 高 传 质 效 率 , 缩 短 生 成 周 期。  增 加 底 物 的 溶 解 性 常 用 的 方 法 有有机溶剂 预溶 解 底 物[ 2 5 ]、 表 面 活 性 剂 增 溶  法[ 2 6 ]、 环 糊 精( C D )增 溶法 等1 2 7 1; 改 变 细 胞 壁( 膜 ) 的 通 透 性 常 用 的 方 法 有 菌 种 突 变、 表 面 活 性 剂 、 原 生 质 体 法 以 及 加 入 细 胞 膜 组 成 成 分 生 物 合 成 抑 制 剂 如 万 3   1  tiiiri  古 霉 素、 鱼 精 蛋 白 等[ 2 8_ 2 91; 解 除 底 物 产 物 的 毒 害 问 题 常 用 的 方 法有 细 胞 固 定 化 、  原 位 分 离、 产 物 即 时 分离 等 , 细 胞 固 定 化 伴 随 的 往 往 是转 化 能 力 下 降 产 物 即 时 分 离 固 然 能 有 效 避 免 产 物 降 解,但 不 利 于 发 酵 最优 化 的 开 发; 而 原 位 分 离 相 比  之 下 能 较 好 解 决 上 述 甾 体 转 化 问 题@, 31], 常 用 的 原 位 分 离 方 法 主 要 有: 溶 剂 萃 取、  发 酵 液 偶 联 透 析 或 超 滤、 添 加 固 体 吸 附 剂 如 活 性炭 、 硅 胶 、 大 孔树 脂 等 实现 原 位  产 物 回 收。  近 年 来 提 出 的 有 机 / 水 两 相 发 酵 系 统 在 底 物 助 溶 传 质 以 及 产 物 分 离 过 程 中 优  势 突 出,但 却 同 时 对 细 胞 有 机 溶 剂 的 耐 受 性 提 出 新 的 挑 战[ 3 2_ 3 31。相 比 之 下,开  发 生 物 友 好 型 的 非 水 溶 剂, 成 了 反 应 工 艺 创 新 尝 试 的一个 重 要 方 向。 两 相 培 养 中 ,  利 用“绿 色”溶 剂 形 成 的 有 机 溶 剂- 水两 相 体 系( 如 超 临 界 流 体 ,离子液 体 , 天  然 油, 液 体 高 聚 物 等 )是 当 今 催 化 介 质 研 宄方 向 的 主 流l 3 4 1。 S t e f a n o v S 等 % 用 豆  油、 菜 籽 油 、 聚 丙 二 醇 ( P P G ) 和 硅 油 构 建 两 相 体 系 , 来 增 加 植 物 甾 醇 的 溶解度,  使得 均切. M B  3 6 8 3转 化 转 化 植 物 甾 醇 为A D的 转 化 率 显 著 提 高。  2 1 1 丨 ” 等[ 3 6 1将 非 离 子 型 表 面 活 性 剂 添 加 到 反 应 体 系 中,创 建“浊 点”发 酵 法, 也  可 理 解 为 是 另 类 有 机 / 水两 相 体 系, 可 明 显 降 低 底 物 与 产 物 的 细 胞抑 制 , 此 系 统  中 当 底 物 质 量 浓 度 为2 5  g / L时, 5 / ? .  N R R L  B-3 6 8 3 静 息 细 胞 转 化  底物 生 成 A D D 的 质 量 浓 度 可 达 到1 2  g / L 。  由 此 可 见, 微 生 物 甾 体转 化 工 艺 正 在 经 历 不 断 完 善 的 过 程 , 不 断 突 破 潜 在 各 类 工 程 瓶 颈, 攻 克 多 项 技 术难 题 , 有 理 由 相 信 , 在 未 来 高 效 率 高 产 能 的 微 生 物 发  酵 工 艺 将 成 为 留 药 工 业 的 重 要 技 术 支 柱。  1. 2 . 2 . 3 微 生 物 甾 体 侧 链 降 解反应 1 9 6 4 年 W h i t m a r c h研 宄 诺 卡 氏 菌 突 变 株 代 谢 胆 固 醇 时, 提 出了 侧 链 降 解 的 机 理 ;1 9 6 8 年S i h 和 W h i t l o c k 又 详 细 研 究 了 胆 固 醇 的 微 生 物 代 谢 途 径 。 通 常,  甾 醇 侧 链 降 解 包 括两 个 重 要 的 过 程:甾 醇 摄 取,C 1 7 位 侧 链 降 解 和 母 核 氧 化 ( 图 1- 2)。  ( 1 )留 醇 摄 取 过 程。留 体 摄 取是 放 线 菌 代 谢 留 醇 的 初 始 步 骤 , 对 整 体 代 谢  通 量 起 重 要 作 用 。 A m x d a  S 等[ 37] 研究 发 现R H A 1的 甾 体 降 解 基  因 簇 中 ,M c e 4甾 醇 转 运 系 统 在 甾 醇 转 运 进 入 细 胞 的 过 程 中 发 挥 作 用。 分 枝 杆 菌 属 中 含 有 四 套 M ce  (1- 4) 操 纵子,编 码 A B C 转 运 蛋 白, A B C 转 运 蛋 白 是一种  依 赖 A T P 的 活 跃 的 转 运 子, 主 要 负 责 将 留 醇 转 运 进 入 细胞[ 3 8 ]。  ( 2 )  C1 7 位 侧 链 降 解 和母 核氧 化。甾 醇 侧 链 降 解 和 母 核 氧 化 在 放 线 菌 中 被 证  明 是 独 立 的 过 程, 这 两 个 过 程 的 顺 序 根 据 不 同 的 微 生 物 而 异。一般 认 为,甾醇 母 核 氧 化 起 始 于 胆 固 醇 3卩- 酮 基 化 及5 位 双 键 异 构 化 为 4 位 双 键 ,是 甾 醇 降解 的 开  始, 这 个 过 程 是 在 胆 固 醇 氧 化 酶 ( C h O ) 或3P- 羟 基甾 醇脱 氢酶( 3 P- H S D) 的 作  用 形 成3- 酮 - 4 - 炼胆 固 醇 ;3 P- HS D 被 认 为 是 M , w 6 e r c w / o 也 与 M s / w e g w a 沿 等 降 解 甾 醇 的 第一步 关 键 酶1 3 9 ], 它 们 是一类 以N A D或 者 N A D P 为 辅 酶, 可 连 续催 化  4    天 津科 技 大 学 硕 士学位 论文  3 p- 羟 基留 醇 脱 氢 与 异 构 反 应 的 酶。 随 后,3- 酮 -4- 烯 胆 固醇 的 进一 步降 解 通 过 C 2 7  位 羟 基 化 的 侧 链 降 解 , 催 化 该 反 应 的 为一类 细 胞 色 素P 4 5 0 加 氧 酶, 例 如 C Y P 1 2 5  与  C Y P 1 4 2  等[ 4 0 ]。 M c L e a n K J  等[ 4丨] 人 解 析了  M 少 的 晶 体 结 构 , 并 证 明 此 酶在 发挥 作用 时 需 要 利 用 N A D ( P ) H 作 为 辅 因 子, 单 加 氧  生 成 羟 基 , 并 伴 随 N A D ( P )+的 生 成。 W u  丫 等[ 4 2 ] 利用 C o / / e r 〇 如/ / m?将 脱 氢  表 雄 烯( D H E A ) 双 羟 化 为 7 t x, 1 5 a- d i O H - D H E A的 研 宄 中, 为 提 高 细 胞 内 N A D P H 的 可 利 用 性, 在发 酵 液 中 加 入 烟 酸 作 为 辅 酶 的 前 体 物 , 通 过 烟 酸 与 葡 萄 糖 构 建 辅  底 物 偶联 体 系 , 使 得 N A D P H / N AD P 比 率 明 显 提 高, 从 而7 a,1 5 a- di O H- D H E A的  摩 尔 转 化 率 从3 7 . 3 7 % 提 升 到 5 0 . 8 5 % 。  侧链 降 解 的 机 理 与 脂 肪 酸 的P 氧 化相 似, 开 始 于 C 2 7 位 羟 基 化 , 再 氧 化 成  C 2 7 位 羧酸, 再 通 过P 氧 化 依 次 失 去 丙 酸、 丙 酸 、 乙 酸 、 最 后 再 失去一个 丙 酸 ,  形 成 C 1 7 位酮 基化 合 物 , 共 涉 及9 种 酶 参 与 的 1 4 步 连 续 的 催 化 反 应; 由 生 物 化  学 基 础 易 知 , 脂 肪 酸 P 氧 化 涉 及 许 多 A T P 和 N A D+的 利 用。 微 生 物 降 解 甾 醇 生  产 AD 的 过 程 包 括 C 3 位 的 羟 基 氧 化 成 酮 基 , C 5, 6 位 双 键 的 氢 化 以 及侧 链 的 降 解[ 4 3 1。  结 合 图 1- 2可 知 , 留 醇 侧 链 降 解 是一个 复 杂 的 氧 化 还 原 过 程 , 辅 因 子 在 其 中 扮 演  着 重 要 的 角 色。  辅 因 子( C o fa c to r s ) 是 指 与 酶结 合 且 在 催 化 反应 中 必 要 的一 类 非蛋白 质 化合 物 ,  分 为 辅 酶、 辅 基和金 属 离 子 三 类, 它 们 和 酶 蛋 白 结 合 以 后 , 能 使酶 具 有催 化活 力 , 紧  密 结 合 的 辅 因 子 , 称 辅 基 , 如 黄 素、 焦 磷 酸 硫胺 素 、 磷 酸 吡 哆 醛 等, 在 许 多 催 化  循 环 中 仍 留 在 酶 的 活 性 部 位 并 再 生; 易 于 解 离 的 辅 因 子 , 称 辅 酶 , 如 N AD ( P ) H 、 A T P 、S A M  ( 腺 苷 蛋 氨 酸 ) 等, 在 催 化 过 程 中 被 转 移 到 底 物 中 并 提 供 官 能 团。  菌 体 的 生 理代谢状 态 与 留 醇侧 链 降 解 密 切 相 关 ,S z e n t i m m i A 等 提 出 辅 因 子 的 再 生 活 性 可 能是 影 响 甾 醇 降 解 的 限 制 因 素。 己 经 推 算[ 4 3 ]以1 单位P- 谷甾 醇  为 准 , 在 其 降 解 至 中 间 物 A D 时 , 共 经 历 1 4 步 酶 促 反 应 , 可 产 生3 分 子 丙 酰 辅 酶 A , 1 分子 乙 酰 辅 酶 A ,3 分 子 N A D H , 3 分 子 F A D H 2; 之 后 丙 酸 盐 和 乙 酸 盐  通过 T C A 循 环 途 径 降 解 , 生 成 1 8 分 子 N AD H ,7 分 子 F A DH 2 以 及 8 0 多 单 位 的 _  A T P。 还 原 型 辅 酶( N A D H 和 F A DH 2 ) 在 电 子 传 递 链 及 氧 气 的 作 用 下 , 生 成 氧  化 性 辅 酶( N A D+) , 使辅 因 子 得 到 有 效 循 环 , 不 同 程 度 的 N A D+ 再 生在 加 速 P S 降 解 过 程 中 十 分 重 要, 但 是 目 前 辅 因 子 工 程 在 分 枝 杆 菌 甾 醇 降 解 途 径 中 的 应 用 研  宄相 对较 少 。  5   1 前 言  丨  厂 n a d h + h+  r t V ^ @ 」 ? r t^j i ^ ^ -。 :2 匕:+ H2。  " 〇 "  X Xj^ rN A D,  NAD+  圆#  4 ? A ^ A, 0 t ojT  r C O A-S H  A T^ k ^N^ A ^O  、 _ H  4* Y  @  3-/ J- n y d r o xys t e r o i d  l]  T  S C 〇 A  f F A D d e h y d r 〇 g e n 〇 ¥ e u i ? A ^ s ^ 〇  ^f a d h2  ( 8 )  3-  k e t o s t e r oi d  i s o m e r c s e  0 ?- o x y g e n a s e  AM P  + p pl  _ _  'Vs ? ^ *>, * ^4 ss c o o h @  al c o h ol  d e h y d r o g en a s e  H2 〇 -  ^ ̄X j 〇?  @  al d e h y d e  de h y d r o g e na s e  @丨  ^ a c v  卜  S C o A  d e h v d r o a e n a s e 1 1  , \  2  4 L A ^ 〇 ■_■ ■ - c ̄ s c o A f e )  m e t h yl-c r o t o n y l  c a r b ox y l a s e  乂  c C 〇A - S H  ^■ 人 : O O H  @  ac y l- S C o A  e n o yl  h y d r a t a s e  J  n C H 0  a c yl - S C o A  t h i o p h o r a s e  C 〇 A-S H  ^  C H2  ( D  卩-i ^ t o  論  l G 5 e  l  1  〇= C - S C 〇 A ( ) P-h y d r o x y a c y l- S C o A  d e h y d r og e n a s e ^ C o A  r l A ? X ^ y P  ^F A DH2  S C o A @ "h y p o t h e t i c a l" p r i m a r y  p r o d u c t  %〇 7 ̄i  ?  / v  O f o r  r e t r oa) < j 〇 l - r e a c t i o n 卜"f  , M A D 人 J  O H  S C o A (  |1 ,  ^N A D H  + H+  C H  C o A- S H  r k x1   S C 〇 A | 3   一一。 = C 一 S C o A  (F AD J @ ^ 〇  、_2  V- LJ  S C O A .  f ;  〇< K ^ k J i  O ?   j  图1- 2分枝杆 菌 降解 谷 甾 醇 生 成 AD[ 4 3 ]  F ig.  1- 2  T r a n s f o r m a ti o n  o f p- s it o s t e r o l  t o  A D  b y  M y cob a c t e r i u m  s p . 1 . 3氧 载 体概 述  1 . 3 . 1 氧 载 体  微 生 物 转 化 多 为 好 氧 发 酵 过 程 , 溶 氧 可 以 直 接 影 响 酶 活 性 及 代 谢 途 径 , 对 微  生 物 的 生 长 和 产 物 合 成 具 有 重 要 的 影 响。氧 在 纯 水 中 的 溶 解度 仅 为 0. 2 5  m o l / L ( 2 5C, 0 . 1  M p a ) , 相对 其它 底 物 来 说 , 由 于 其 在 培养 液中 溶 解度 极低 ,常 常  成 为 需 氧 发 酵 过 程 中 提 高 产 率 的 限 制 性 因 素1 4 4 1。 传 统 的 改善 氧 传 递 方 法 主 要 是  6    天 津 科 技大 学 硕 士学 位 论 文  从 反 应 器 的 设 计 、 增 加 搅 拌转 速、 通 风 以 及 提 高 氧 分 压 等方 面来 加 以 考 虑, 然 而  较 高 的 搅 拌 转 速 带 来 很 大 的 剪 切 力 , 不 仅 损 伤 菌体 细 胞 、 影 响 产 物 的 合 成, 也导  致 发 酵 液 中 泡 沫 增 多 , 不 易 控 制 等 从 而 操作 范围 有 限 , 而 且 增 加 了 运 行 费 用 和 设  备 成 本。 近 年 来 出 现 的 氧 载 体 两 相 系统 被公 认 为 是 有 效 改善 和 控 制 发 酵 液 溶 氧 的  新 技 术。  氧 载 体( O x y g e n v e c t o r ) 是一类 具 有 比 水 更 高 的 溶 氧 量 的 液 体。 在 发 酵 液 中 引 入 氧 载体 可 以 减 少 气 液 两 相 间 的 传 氧 阻 力,提 高 传 氧 效 率, 这 样 的 发 酵 体 系 统  称 为 两 相 发 酵 系 统 , 其 目 的 是 为 了 强 化 单 液 相 发 酵 体 系 中 的氧传递 过 程 ; 这 是 传  氧 技 术 的 主 要 发 展 方 向 之一, 可 在 不 增 加 能 耗 的 基础 上 提 高 溶 氧 传 递 效 率[ 4 5 ]。  目 前 , 常 用 的 氧 载 体 主 要 有 全 氟 化 碳 、 液 态 烷 烃、 煤 油 、 硅 油 、 油 酸和 豆 油 等 。  1 . 3 . 2 氧载 体 的 分 类  根 据 分 散 相 与 连 续 相的 概 念 , 将 氧 载 体 强 化 供 氧 体 系 分 为 两 类[ 4 6 ]: 类 是  油 相 分 散 在 水 相 中 ( 0 / W 型 ) , 即水 是连 续 相,油 是 分 散 相; 第 二 类 是 水 相 分  散 在 油 相 中( W / O 型)。而 根 据 铺展 系 数Sp 的 不 同, 也 可 以 把 氧 载体 分 为 两 类 :  铺 展 系 数 为 正 值 ( S p > 0 ) 的 氧 载 体 和 铺 展 系 数 为 负 值( Sp< 0) 的 氧 载 体。 当Sp > 0 时 ,一 方 面油 相 铺 展 于 水 的 表 面 , 形 成一层 薄 的油 膜 , 由 于 油 相相 对 氧 的 高 溶 解  能 力 , 使 穿 过 水 边 界 层 及 油 膜 的 渗 透 力 增 加 , 从 而 使 液 膜 传 质 系 数l a 增 大;另  一方 面 , 氧 载 体 的加 入 使 气泡 表面 被 油 膜 覆 盖 , 表 面 张 力 降 低 , 使 气 泡 直 径 呈 减  小 趋 势 ( 表 面张 力 小 ,气 泡容 易 拉 长 , 当 长 短 径 比 大 于3 时, 易 发 生 断裂 ) , 因  而 使 气 液 比 表面 积a值 增 加, 表 现 为 体 积 溶 氧传质系 数 ( k L a ) 随 氧 载 体 浓 度 的  增 加 而 增 大 ; 当Sp< 0时 , 氧载 体在 水 表 面 不 铺 展, 形 成一晶 状 液 滴 , 浮 在 表 面 ,  经 过 通 风 、 搅拌 等 打 散 后 , 这 些 分 散 的 小 油 滴 将 聚 集 在 气 液 界面 上 , 形 成 气 泡 、 油、 水 的 复 合 体, 在 氧 载 体 溶 度 低 时 , 油 相 微 滴 对 的 影 响 不 大 , 但 此 时 气 泡  直 径 大 大 减 小 , 气 液 比 表 面 积 a 增 大 , 宏 观 表 现 为 k L a 随 油 相 分 数 的 增 加 而 增 大 ,  当 油 相 分 数 增 大 到一定 数 值 后 , 这 两 方 面 影 响 的作用强 弱 发 生 了 变化 ,l a a开 始  下 降, 甚 至 可 能 下 降 到 低 于未 加 油 相 时的 值[ 4 7 ]。  1 . 3 . 3 氧 载 体 强化 传氧 的 机 理 模 型  在 双 相 发 酵 体 系 中, 由 于 存 在 气、液 ( 水 和 油 )、固 ( 细 胞 ) 三 相 组 成 的 多 个  界 面, 使 氧 的 传 质途 径 变 得 较 为 复 杂。 研 宄 己 证 明[ 4 8 】, 动态操作 过 程 中, 在 油 水  两 相 之 间 存 在 着 传 递 过 程, 其 传 质 速 率 取决 于氧在 两相 间 的 传 质 阻 力 和 推 动 力 大  小。 氧 在 油 相 中 的 浓 度 比 水 相 中 要 大 得 多 , 使 得 氧 穿 过水 边 界 层 的 渗 透 力 增 强,  提 高 总 的 传 质 推 动 力 , 从 而 提 高 了 总 的 氧 传 递速 率; 同 时,由 于 存 在 着 油一水 传  氧 途 径, 在 实 际 发 酵 过 程 中 ,随 着 菌 体 不 断 消 耗 氧 , 水 中 的 氧 浓度 下 降 , 打 破 了  氧 在 油 水 两 相 间 的 平 衡 , 使 油 相 中 的 氧 不 断 传 至 水相, 有利 于供氧水 平 的 提 高。  氧 的 传 递 途 径 有  5  条( 图  1 - 3) :  G- W - C、 G- C、 G- 0 - W - C、 G- O - C、 G- W - 0 - C 【 4 9 ]。  考 虑 到吸 附于 气 泡 表 面 上 进 行 呼 吸 的 菌 体 量 远 小 于 总 细 胞 量及 气泡 的 稳 定 性 等  7   1前 言  因 素,第2 条 途 径 可 以 排 除; 如 果 细 胞 对 氧 载 体 没 有 亲和 力,即 菌 体 与 氧 载 体 相  不 直 接接 触, 则 G- 0 - C和 G- W - O C两 条 途 径 不 存 在, 若 氧 载 体 对 细 胞 有 亲 和 力,  则 上 述 两 条 途 径 必然存在。由 于 微 生 物 仅 利 用 水 相 中 的 溶 解 氧,因 此 水 相 与 氧 载  体 间 的 氧 传 递 严 格 讲 应 为 0- W。  #  C E L L ^  V E C T OR  0  ⑷ W A T E R 4  3 图1- 3氧 载 体 发 酵 体 系 中 氧 传 递 物 理 模 型 示 意 图1 4 9 1  Fi g .  1- 3 Di g a r m a  o f p h y si c a l  m o d e l  o f  o x y g e n  t r an s fe r i n  o x y g e n  v e c t o r  f e r m e t a t ti o n 注 : l. G - W - C;  2. G - C ; 3. G- V - W - C;  4. G- 0 - C;  5. G- W - 0 - C G- 气 泡: W- 水; C- 细 胞: O- 氧载 体 1 . 3 . 4 氧 载 体 的 优 点 及 应 用  氧载 体 的 溶 解 氧( D i s s o l v e d  O x y g e n ,D O )能 力 约 为 水 的1 5- 2 0倍,与 传  统 发 酵 系 统 相 比, 具 有 以 下 优 点[ 51, 5 2 ]:  (1) 传 递 速 度 快 , 氧 的利 用率 高;  ( 2 ) 降 低 鼓 泡 和 搅 拌 对 微 生 物 的 损 伤;  ( 3)能 耗 低 ;  ( 4 ) 提 供 多 相 界 面,利 于D O的 有 效 传 递 ;  ( 5) 延 长 微 生 物 存 活 率;  ( 6 )易 于 灭 菌 ;  ( 7 )易 于 恢 复 和 循 环 利 用。  在一些 好 氧 微 生 物 发 酵 过 程 中 加 入 氧 载 体, 可 以 提 高 同一发 酵 系 统 的 氧 传 递  系 数 值3 0- 4 0 0 %, 或达 到 同一混 合 效 果 降 低搅 拌 功 率 3 0 % 以 上 的 优 点15 3], 这 样  的 反 应 系 统 不 仅 适 合 于 好 氧 高 密 度 发 酵 , 也 适 合 于 如 溶 氧 功 耗 高 , 或 因 大 量 气 泡  产 生 使 设备 生 产 能力 降低, 或 因 剪 切 作 用 大而 难 以 大 规 模 培 养 的 脆 弱 细 胞 菌 体 的 培 养 , 同 时 也 可 应 用 于 固 定 化 生 物 催 化 剂 的 好 氧 反 应 中, 并 且 常 用 的 氧 载 体 如 液  态 烷 烃 和 各 种 油 类 等 的 价 格 低 廉, 从 经 济 角 度 来 看, 更 适 于 大 规 模 发 酵 生 产,因  此 氧 载 体 发 酵 体 系 越 来 越 受 到 人 们 的 关 注, 常 见 氧 载 体 的 应 用 介 绍 如 下:  ?    天 津 科技 大 学 硕 士 学 位 论 文  全 氟 化 碳 是一类 环 形 或 直 链 的 碳 氢 化 合 物, 结 构 中 氢原 子被 氟 原 子 取 代。 液  态 全 氟 化 合 物 ( P e r fl u o r o c a r b o n s, P F C s ) 溶 氧 能 力 约 为 水 的 2 0 倍 , 且 稳 定 无  毒 耐 高 温 , 气 体 在 PF C s 内 的 溶 解 能 力 依次 为C 〇 2 > 〇 2 > C O > N 2 > H 2 > H e , 因 而 它 可  以 较 多 地 吸 收C 0 2 释 放 0 2 , 是一种 很 好 的氧 载体[ 5 4 ]。对 于 连 续 生 物 反应 系统 ,  全 氟 化 碳 能 更 好 的 提 高 总 体 生 物 量 和 生物 反应 器 的 性 能。 E l i b o l等[ 551 利用51.  生 产 放 线 菌 紫 素 时 向 发 酵 液 中 加 入1 0 %  ( v / v) 的 P F C , 发 现 发 酵 液 中  溶 氧 浓 度 提 高 了  2 倍 , 放 线 菌 紫素 产 率 也 提 高 了 近2 倍 。 M e y e r A 等[ 5 6 ] 研 究 发 现 P F C s 对 0 2 的 溶 解 性 与 F 原 子 数 成 正 。

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